青岛市曾公布青岛病例病毒基因组序列，并公布了青岛的疫情全基因测序结果与我国本土和入境人员病例基因库比对情况。通报中这些专业结论是如何得到的?新冠病毒的全基因组测序工作又是如何开展的？2022年3月30日，半岛记者跟随青岛市疾病预防控制中心应急检测组，了解新冠病毒全基因组测序的方方面面。

全基因测序确定病毒的基因型别

来到青岛市疾病预防控制中心的微生物检验科，长长的走廊两边都是不同功能的实验室。根据工作划分，实验室配备了核酸提取仪、核酸定量仪、荧光定量 PCR 仪、普通 PCR 仪、全自动分子诊断系统、全自动分杯处理系统和二代测序仪等先进仪器设备。据工作人员的介绍，市疾控中心承担了全市新冠病毒疑似阳性样本的复核和全基因组测序工作。

“一旦全市医疗卫生机构、第三方检测机构等具有新冠病毒核酸检测资质的单位筛查出阳性的样本，就会将样本送到市疾控中心新冠实验室。对于复核阳性的首发病例、指示病例及入境人员病例的核酸样本，我们会将在第一时间进行全基因组测序工作，来确定病毒的基因型别，并进行新冠病毒基因溯源。”市疾控中心微生物检验科主任、应急检测组组长汪照国介绍。

四个步骤完成测序

找到病毒基因溯源

工作人员介绍，新冠病毒基因测序和溯源有一个相对标准化的流程，从样本接收到确定新冠奥密克戎变异株亚型，需要大致四个步骤：核酸提取和检测、RNA逆转录病毒全长捕获、文库构建与上机测序、生物信息学分析（序列分析）。

第一步：核酸提取和检测

经过核酸检测，确定为阳性的首发病例、指示病例、入境人员以及需要追踪传播链条的病例都将挑选其病毒载量，符合测序条件的样本，进行全基因组测序工作。

第二步：病毒全长捕获

“工作人员在进行样本采集时，除了新冠病毒，我们呼吸道上的细胞、细菌甚至其他病毒都会随着棉签一起进到采样管里。由于新冠病毒属于RNA病毒且含量相较其他成分不占优势，我们工作的第一步就是要在这个复杂的环境中找到新冠病毒。我们通常是利用根据分子生物学原理设计的试剂盒，先将潜在的RNA新冠病毒逆转录成DNA片段，并根据新冠病毒的特性单独将其捕获出来。”应急检测组刘子然介绍。

第三步：文库构建和上机测序

这一步的目的是将捕获产物纯化后，再通过片段化等一系列操作将片段处理成测序仪可识别的程度为后续上机测序做铺垫，产物称之为文库。“这步骤的实验操作非常有技术含量，也是非常关键的一步。专业人员的实验操作会影响到整个基因测序结果。”山东省疾病预防控制中心传染病防制所李岩介绍：“无论人还是环境的样本，都需要实验人员因地制宜地结合丰富的实验经验进行专业的操作，以达到最佳的质量进行上机。所以我们要求检测人员必须具有丰富的经验和过硬的技术，青岛的这几位实验人员已经具备了这项能力，他们的建库能力我非常放心。”

第四步：生物信息学分析

“实验室现有仪器设备每台最多能完成大约100个样本的测序工作，这个过程通常需要19-24个小时。在这期间，测序仪会根据不同的信号将新冠病毒进行识别与拼接。随后我们会对机器拼接的数据结果进行判读，转化成准确完整可靠的序列数据，这是生物信息分析环节中技术含量最高的部分。有时几个突变位点的差异就能揭示不同病例之间的传播关系，所以得到一条准确完整的序列对溯源工作至关重要。”应急检测组周彤告诉记者。

拼接完成的病毒序列与已知数据库的比对结果，可以为溯源工作提供参考依据。如果序列在同一进化树分支上，则可以判断这些病例是否来自同一传播链或传染源。

40个小时即可出结果

刘思彤解释，完成数据比对后，还要及时撰写全基因组测序分析报告。每个病例基因组序列全长多少，为奥密克戎变异株哪一进化分支，与哪个首发或指示病例共享最多突变位点，或又在此基础上增加了哪个突变位点，推断可能与哪次疫情为同一传播链。若青岛的数据库查无此例，则需要与省疾控、国家疾控的数据库进行比对。

“国家对新冠病毒测序工作要求的时长是72小时出结果，经过我们团队的不断努力，可以40个小时完成样品的接收、处理与分析工作。对于一些特殊的样本，最快可以在24小时内得到测序结果。全基因组测序工作在国家和省级专家的支持下，在青岛市各级领导的关怀下，有了突飞猛进的发展。”汪照国介绍，青岛市疾控还具有第三代全基因组测序能力。二代和三代测序技术相结合，能够为突发公共卫生事件中的全基因组测序工作设置“双保险”。